Mutacje telomerazy u rodzin z idiopatycznym włóknieniem płuc cd

Amplicony hTERT były sekwencjonowane w jednym kierunku, a podejrzane zmiany zostały potwierdzone w przeciwległym pasmie. Mutacje w probantach i ich krewnych potwierdzono przez dwukierunkowe sekwencjonowanie. Sekwencje sprawdzano ręcznie za pomocą oprogramowania Sequencher, a warianty porównywano z publicznymi bazami danych. Wersje kodujące i niekodujące są wymienione w Tabeli 3 Dodatkowego Załącznika. Telomery i telomeraza
Test odwrotnej transkryptazy-reakcji łańcuchowej polimerazy (RT-PCR) przeprowadzono z użyciem RNA wyizolowanego z krwi obwodowej do wytworzenia komplementarnego DNA (cDNA). Startery zaprojektowano tak, aby obejmowały eksony, w których przewidziano mutację zmieniającą splicing; sekwencje starterów są dostępne na życzenie. Produkty PCR zostały sklonowane, a sekwencja została zweryfikowana.
Średnią długość telomerów mierzono w limfocytach krwi obwodowej za pomocą fluorescencyjnej hybrydyzacji in situ (FISH), jak opisano powyżej28.
Powstały mutacje punktowe, a kompleks telomerazy został odtworzony in vitro.24 Aktywność telomerazy została przetestowana bez amplifikacji, z użyciem zmodyfikowanego testu bezpośredniego.29,30
Wyniki
Mutacje wpływające na składniki telomerazy
Spośród 73 probantów poddanych badaniom przesiewowym 6 (8%) miało mutacje heterozygotyczne w hTERT lub hTR. Pięć probantów miało mutacje w hTERT (dwa bzdury, dwa połączenia splotów i jedno przesunięcie ramki odczytu), a jeden proband miał mutację w hTR (Tabela i Figura Dodatkowego Dodatku). Żadna z mutacji hTERT nie była obecna u 623 nie dotkniętych chorobą osób, co ustalono w innych badaniach.23,31 Spośród tych osób 140 określiło siebie jako białe, a reszta opisuje siebie jako czarnych, hiszpańskich lub azjatyckich. Mutacja hTR była również nieobecna w 194 zdrowych kontrolach. Spośród tych osób 123 określiło siebie jako białe, a pozostałe osoby opisują siebie jako czarne, latynoskie lub azjatyckie.22
Mutacje związane z chorobą i krótkimi telomerami
Rysunek 1. Rysunek 1. Rodowody sześciu probantów z mutacjami telomerazy. Strzałki wskazują na proband w każdej rodzinie, a pogrubione kursywa oznaczają osoby, dla których DNA było dostępne do sekwencjonowania. Osoby, u których zmierzono długość telomerów są oznaczone gwiazdkami. Status mutacji jest wskazywany przez symbole pokazane na klawiaturze, z kwadratami wskazującymi płeć męską i kółkami wskazującymi płeć żeńską. Zmarli członkowie rodziny są oznaczani ukośnikami poprzez symbole. W Family D przedmiot DII.1 jest obowiązkowym nosicielem, zważywszy, że dwoje jego dzieci nosi mutację, a matka nie. Łącznie 19 pacjentów z potwierdzonym idiopatycznym zwłóknieniem płuc znajduje się wśród sześciu pokazanych rodzin. Siedmiu bezobjawowych nosicieli młodszych pokoleń było średnio o 11 lat młodszych od probantów w momencie rozpoznania: 40, 44, 46, 50, 52, 55 i 68 lat. W rodzinie F u trzech pacjentów stwierdzono niedokrwistość aplastyczną, a podmiot FIII.16 zmarł z powodu ostrej białaczki szpikowej, prawdopodobnie w warunkach niedokrwistości aplastycznej. IPF oznacza idiopatyczne zwłóknienie płuc.
Aby ustalić, czy mutacje telomerazy są segregowane z idiopatycznym zwłóknieniem płuc w rodzinach, zbadaliśmy rodowody
[więcej w: opieka nad dzieckiem zus, lekarz medycyny pracy poznań cena, dieta pudełkowa menu ]